產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO固著液A（Reagent A）  毫升
HEPENGBIO固著液B（Reagent B）  毫升
HEPENGBIO清理液（Reagent C）    毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent D）      毫升
HEPENGBIO顯色液A（Reagent E）  毫升
HEPENGBIO顯色液B（Reagent F）  毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份
 
保存方式
 
保存在4℃冰箱里，避免光照；試劑具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證3月
 
用戶自備
 
30％蔗糖：用于樣品脫水處理
無(wú)離子水：用于工作液的配制
1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器
無(wú)菌手術(shù)刀和鑷子：用于解剖動(dòng)物腦組織
小型玻璃染色缸：用于組織或切片處理的容器
切片機(jī)：用于組織切片
明膠化載玻片和蓋玻片：用于切片后鋪片
中性樹(shù)脂：用于切片封片
光學(xué)顯微鏡：用于切片染色后觀察分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
一、 樣本固著處理
 
1． 常規(guī)麻醉動(dòng)物和手術(shù)（建議：使用生理鹽水由心臟處灌注三次，每次60毫升，去除血液直至澄清；如果切片易碎，可以使用無(wú)離子水快速?zèng)_洗組織替代灌注）
2． 即刻小心取出腦組織
3． 用無(wú)菌手術(shù)刀將腦組織切成0.5厘米厚的組織塊
4． 即刻用無(wú)菌鑷子夾起組織塊 
5． 小心轉(zhuǎn)移到含有xx毫升HEPENGBIO固著液A（Reagent A）和xx毫升HEPENGBIO固著液B（Reagent B）的混合液里（20毫升/2塊組織塊）
6． 室溫下浸泡孵育2周，避免光照
7． 小心轉(zhuǎn)移到用戶自備的30％蔗糖溶液里
8． 在4℃溫度下浸泡孵育48小時(shí)，或組織沉底，避免光照（注意：不宜超過(guò)1周）
9． 用綿紙或?yàn)V紙吸干組織塊
10． 放進(jìn)－20℃冰箱里
11． 取出組織塊，在－20℃條件下進(jìn)行包埋后，緩慢冰凍切片，為40至150微米厚，并鋪片在明膠化載玻片上（注意：碎片是常見(jiàn)現(xiàn)象，參考注意事項(xiàng)3和4）
12． 置于－20℃冰箱里保存
 
二、 樣本染色處理
 
準(zhǔn)備一個(gè)20毫升塑料瓶，加入10毫升用戶自備的無(wú)離子水，然后分別加入xx毫升HEPENGBIO顯色液A（Reagent E）和HEPENGBIO顯色液B（Reagent F），混勻，標(biāo)記為HEPENGBIO顯色工作液（有效使用10天），避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
 
1． 取出待測(cè)的40至150微米厚的冰凍組織切片
2． 室溫下，小心將切片置入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent C）中孵育1分鐘
3． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent C）
4． 小心加上x(chóng)x微升HEPENGBIO染色液（Reagent D），鋪滿整個(gè)切片樣品表面
5． 室溫下孵育30分鐘
6． 小心移去切片上的HEPENGBIO染色液（Reagent D）
7． 室溫下，小心將切片置入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent C）中孵育1分鐘（注意：反復(fù)輕柔攪動(dòng)，清洗完全）
8． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent C）
9． 小心加上x(chóng)x微升HEPENGBIO顯色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
10． 室溫下孵育10至30分鐘，直至呈現(xiàn)黑色，即刻終止，避免光照（注意：期間可以在顯微鏡下觀察）
11． 小心移去切片上的HEPENGBIO顯色工作液
12． 室溫下，小心將切片置入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent C）中孵育1分鐘
13． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent C）
14． （選擇步驟）進(jìn)行復(fù)染操作（建議使用HEPENGBIO甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）復(fù)染試劑盒－HEPENGBIO80052）
15． 透明處理
16． 放上蓋玻片或封片（中性樹(shù)脂）
17． 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：神經(jīng)元、錐體細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、少突觸膠質(zhì)細(xì)胞（橢圓形如同串珠）和其它突起，呈現(xiàn)黑色（如果復(fù)染――細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，胞漿尼氏（體）物質(zhì)呈現(xiàn)粉紅至紫色）
 
注意事項(xiàng)
 
1． 本產(chǎn)品為20次（40塊組織和20次染色）操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 如果樣品切片時(shí)，出現(xiàn)組織碎片，建議：第一，蔗糖處理72小時(shí)或直至組織沉底；第二，使用異戊烷快速冷凍組織30秒至1分鐘，后續(xù)包埋后，再行—19℃均衡溫度后切片；如果無(wú)法解決，建議使用震動(dòng)切片或石蠟切片等；第三，使用震動(dòng)切片前，置于6%蔗糖或加入50微升HEPENGBIO清理液（Reagent C）濕潤(rùn)后再行切片
4． 快速冷凍切片操作要點(diǎn)：固定處理后，30%蔗糖浸泡，第一個(gè)12小時(shí)換液一次，繼續(xù)浸泡至72小時(shí)，可長(zhǎng)達(dá)1周
1） 準(zhǔn)備300毫升異戊烷在干冰里30分鐘，溫度達(dá)到-70℃
2） 將組織放在網(wǎng)架容器，緩慢放進(jìn)異戊烷里30秒至1分鐘。理想狀態(tài)是組織完全冰凍，如果時(shí)間過(guò)久，組織會(huì)碎裂
3） 迅速取出，用預(yù)冷的棉紙去除殘留異戊烷
4） 錫紙包裹，-70儲(chǔ)存或準(zhǔn)備切片
5） 切片機(jī)溫度-19℃
6） 組織塊容器置于干冰中，加入包埋液在容器里，包埋液凍住后，放進(jìn)組織塊，再加入少量包埋液在組織塊上
7） 緩慢切片
5． 關(guān)于切片制備，參考論文《臨床和實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志》2017 Jan 33（1）,113-116頁(yè)（王蕾 張芳 湯仁仙 張冠群 牛海晨）
6． 試劑具有腐蝕性，注意操作安全，尤其使用HEPENGBIO染色液（Reagent D）
7． 鋪片須使用明膠化載玻片，否則染色會(huì)掉片：第一用毛筆涂刷；第二保持濕潤(rùn)3小時(shí)；第三用PARAFIN包裹后壓片
8． 切片建議100至200微米，過(guò)厚和過(guò)薄不利于檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞
9． 建議使用玻璃染色缸
10． 每次更換試劑溶液時(shí)，保持切片面基本晾干
11． 試劑溶液在切片表面時(shí)，避免有氣泡存在，同時(shí)確保鋪滿切片表面
12． 整個(gè)操作，在避光狀態(tài)下進(jìn)行
13． 染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察 
14． 樣品染色后保存，避免光照
本公司提供系列組織細(xì)胞神經(jīng)系統(tǒng)成分染色試劑產(chǎn)品