凝血酶（THROMBIN；EC3.4.21.5），又稱為活化因子IIa（Activated Factor Iia），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液循環(huán)中的凝血蛋白。其原酶分子量是72kd，由活化因子Xa（Activated Factor Xa）所切離產(chǎn)生的活化凝血酶分子量是36kd。其功能在于將血漿中可溶性纖維蛋白原（fibrinogen）轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白凝塊（fibrin clot），活化因子XI、V、VIII，XIII等，以及促進血小板聚集等凝血機制方面發(fā)揮重要作用。凝血酶影響一系列正常和病理反應，包括炎癥、組織修復、胚胎形成、血管形成、腫瘤浸潤等。凝血酶基因突變將導致血栓形成（thrombosis）。凝血酶的目標蛋白切離部位為Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。尿激酶的抑制劑是苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride；PMSF）?；谌斯ず铣傻亩嚯幕衔锏孜颒-D-Phe-Pip- Arg-pNA（HD-苯丙氨酰- pipecolyl-精氨酰對硝基苯胺）受到凝血酶的水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定凝血酶的活性。其反應系統(tǒng)為：
 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO緩沖液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent B）   毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent C）   微升
產(chǎn)品說明書    1份
 
保存方式
 
保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent C）避免光照和反復凍融；有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器
微型臺式離心機：用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱：用于反應物孵育
酶標板或比色皿：用于樣品比色測定的容器
酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析
 
實驗步驟
  
一、 樣品制備
 
1． 準備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
3． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4． 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
5． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
6． 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
 
二、 測定準備
 
1． 準備好上述制備的待測樣品
2． 設定好酶標儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零
3． 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照。HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度
 
三、 活性測定
 
1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）到相應孔中
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent B）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent C）
5． 輕輕搖動96孔酶標板（注意：避免氣泡）
6． 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見反應孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
7． 即刻放進酶標儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
8． 活性計算：
 
（1） 酶標儀檢測
 
 
（2） 比色皿檢測
 
 
注意事項
 
1． 本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品須澄清，且避免反復凍融
5． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)60分鐘
6． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
7． 樣本測定60分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
8． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒HEPENGBIO30030.1）
9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
10． 可以使用凝血酶抑制劑，N-α-NAPAP，作為抑制劑對照或陰性對照
11． 凝血酶單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-pNA所需的酶量作為一個活性單位
本試劑盒只能用于科學研究，不得用于醫(yī)學診斷或其他用途。