糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又稱為粘多糖（mucopolysaccharide），是體內(nèi)最為豐富的異源多聚糖。糖胺多糖是一種未分叉的負(fù)電荷性長鏈多聚糖，由重復(fù)的二糖單位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），鏈接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖與核心蛋白（core protein）共價(jià)相聯(lián)，構(gòu)成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成為細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成過程中發(fā)生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于發(fā)揮各種不同的作用，包括酶的調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、生長、遷移、分化，以及組織損傷反應(yīng)?；谔前范嗵堑母叨蓉?fù)電荷的特點(diǎn)，使用異染性（metachromatic）陽離子藍(lán)色染料二甲基亞甲基藍(lán)（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性條件下，特異性的結(jié)合產(chǎn)生不溶性紫色或粉紅色糖胺多糖染料復(fù)合物（Dye-GAG complex），在丙醇解離溶液中，釋放出染料，通過分光光度儀（656nm波長）測(cè)定，來定量分析糖胺多糖的總含量。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）         120毫升
HEPENGBIO萃取液（Reagent B）        20 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C）   25 毫升
HEPENGBIO解離液（Reagent D）   25 毫升
HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）    100微升
產(chǎn)品說明書    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO萃取液（Reagent B）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO染色液（Reagent C）避免光照；有效保證3月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離
恒溫水槽或干式恒溫儀：用于樣品反應(yīng)
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
一、樣品預(yù)處理  
 
1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入500微升HEPENGBIO萃取液（Reagent B）
10． 放進(jìn)一個(gè)1.5毫升離心管
11． 強(qiáng)力渦旋震蕩1分鐘，充分混勻
12． 放進(jìn)56℃恒溫水槽孵育16小時(shí)
13． 放進(jìn)90℃恒溫水槽孵育10分鐘
14． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
15． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
16． 置于冰槽里備用
 
二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制
 
1． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
2． 分別加入50微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到1至5號(hào)管
3． 移取50微升HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻
4． 小心移取50微升1號(hào)管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻
5． 小心移取50微升2號(hào)管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻
6． 小心移取50微升3號(hào)管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻
7． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
 

管號(hào)	HEPENGBIO清理液（Reagent A）	HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）	標(biāo)準(zhǔn)糖胺多糖含量
1	50微升	50微升	5微克
2	50微升	50微升1號(hào)管	2.5微克
3	50微升	50微升2號(hào)管	1.25微克
4	50微升	50微升3號(hào)管	0.625微克
5	50微升	0	0

 
 
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
 
1． 移取50微升上述配制的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1.5毫升離心管
2． 加入1毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 渦旋震蕩15秒
4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒
5． 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g
6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）
7． 加入1毫升HEPENGBIO解離液（Reagent D）
8． 渦旋震蕩15秒
9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）
10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)（波長656nm）：獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光讀數(shù)
12． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至11四次
13． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)糖胺多糖含量（微克）
 
四、 樣品測(cè)定
 
1． 加入50微升上述制備的待測(cè)樣品到1.5毫升離心管
2． 加入1毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 渦旋震蕩15秒
4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒
5． 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g
6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）
7． 加入1毫升HEPENGBIO解離液（Reagent D）
8． 渦旋震蕩15秒
9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）
10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)（波長656nm）：獲得樣品吸光讀數(shù)
12． 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)糖胺多糖含量（微克）
 
五、 濃度計(jì)算
根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品對(duì)應(yīng)糖胺多糖含量（微克）÷0.050（樣品容量；毫升）=微克糖胺多糖/毫升