生物體獲得能量的基本途徑是氧化還原反應(yīng)，即通過電子供體和受體之間的電子傳遞釋放而來。在無氧條件下，硝酸鹽作為終端電子受體，在硝酸鹽還原酶（nitrate reductase；NaR）的存在下，進(jìn)行硝酸鹽還原反應(yīng)，成為大多數(shù)微生物獲得能量的途徑之一。氮元素（nitrogen；N2）是生物體的生命元素，幫助參與產(chǎn)生蛋白質(zhì)、核酸等生物分子。所有氮循環(huán)（nitrogen cycle）中的還原反應(yīng)過程都包含通過硝酸鹽還原酶催化的硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的反應(yīng)。原核生物硝酸鹽還原酶是一種單核含鉬的氧化還原酶，其分為三種：以硝酸鹽為終端電子受體的呼吸異化型（respiratory dissimilatory；EC1.7.99.4）、周質(zhì)異化型（periplasmic dissimilatory；EC1.7.99.4）和參與硝酸鹽同化的同化型（assimilatory；EC1.9.6.1）硝酸鹽還原酶。同化型也存在于高等植物和藻類等，是由含Mo、黃素和正鐵血紅素的亞單位所構(gòu)成，分子內(nèi)具有小的電子遞體。細(xì)菌的電子供體主要為NADPH，可由硝酸鹽誘導(dǎo)，可被氨和有機(jī)氮抑制。異化型酶存在于許多兼性好氧性細(xì)菌，多為與膜結(jié)構(gòu)結(jié)合，且不溶性。一般含鐵及鉬，以細(xì)胞色素為電子供體；而專性嫌氣性細(xì)菌產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的酶是可溶性的，以鐵氧還蛋白為電子供體。大腸桿菌硝酸鹽還原酶由4個142Kd和4個58Kd多肽構(gòu)成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，分子量為800Kd?；诘孜锵跛猁}（nitrate），在還原型甲基紫精（methyl viologen）（替代細(xì)胞色素）作為電子供體的參與下，通過異化型硝酸鹽還原酶（dissimilatory nitrate reductase；D-NaR）的催化作用，而還原為亞硝酸鹽，進(jìn)而通過格里斯試劑（Griess Reagent）氨苯磺胺（sulfanilamide）和N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽（N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride；NED），在酸性條件下的重氮化（diazotization）反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅或粉紅色的偶氮化合物（Azo compound），通過其吸光峰值的變化（540nm波長），來定量分析異化型硝酸鹽還原酶的活性。其反應(yīng)方式為：
 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO裂解液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent B） 微升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO還原液（Reagent E1） 管
HEPENGBIO稀釋液（Reagent E2） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）      毫升
HEPENGBIO顯色液（Reagent G）      毫升
HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 微升
產(chǎn)品說明書      1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO活性液（Reagent B）、HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）和HEPENGBIO還原液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）和HEPENGBIO顯色液（Reagent G）避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
15毫升錐形離心管：用于樣品操作
1.5毫升離心管：用于制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的容器
微型臺式離心機(jī)：用于樣品處理
恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育
96孔板或比色皿：用于比色的容器
酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：波長540nm，并置零。然后進(jìn)行下列操作。
 
一、樣品準(zhǔn)備
 
選擇一：培養(yǎng)細(xì)菌
1． 準(zhǔn)備好500微升待測細(xì)菌（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
2． 轉(zhuǎn)移到到1.5毫升離心管
3． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
4． 小心抽去上清液
5． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混勻
6． 加入xx微升HEPENGBIO活性液（Reagent B）
7． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
8． 置于冰槽里15分鐘
9． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
10． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
11． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
12． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
選擇二：細(xì)菌培養(yǎng)液
1． 移取1毫升細(xì)菌培養(yǎng)液到1.5毫升離心管
2． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
3． 小心移取1毫升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
4． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制
 
1． 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
2． 分別加入xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到2至5號管
3． 移取xx微升HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號管
4． 小心移取xx微升1號管的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號管，混勻
5． 小心移取xx微升2號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號管，混勻
6． 小心移取xx微升3號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號管，混勻
7． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
 

管號	HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）	HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）	標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽濃度
1	－	xx微升	xx微摩爾/升
2	xx微升	xx微升1號管	xx微摩爾/升
3	xx微升	xx微升2號管	xx微摩爾/升
4	xx微升	xx微升3號管	xx微摩爾/升
5	xx微升	0	0

 
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升上述配制的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）
3． 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
4． 室溫下孵育20分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
6． 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
7． 室溫下，孵育5分鐘
8． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent G）
9． 室溫下，孵育5分鐘，避免光照
10． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
11． 重復(fù)實驗步驟1至10四次
12． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽濃度（微摩爾/升）
 
四、 樣品測定
 
測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO還原液（Reagent E1）和HEPENGBIO稀釋液（Reagent E2）置于冰槽里融化，然后移出xx微升HEPENGBIO稀釋液（Reagent E2）到xx管HEPENGBIO還原液（Reagent E1），混勻后，置于冰槽里備用；用畢即刻放進(jìn)－70℃保存。再將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）置入冰槽里融化，然后移出40微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升上述配制的HEPENGBIO還原液（Reagent E），輕柔槍頭混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為HEPENGBIO反應(yīng)工作液，放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入50微升上述準(zhǔn)備的待測樣品（注意：細(xì)菌裂解樣品為50微克蛋白）
3． 加入xx微升含有HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）和HEPENGBIO還原液（Reagent E）的HEPENGBIO反應(yīng)工作液
4． 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
5． 室溫下孵育20分鐘（注意：細(xì)菌培養(yǎng)液上清樣品可以延長孵育至60分鐘）
6． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
7． 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
8． 室溫下孵育5分鐘
9． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent G）
10． 室溫下孵育5分鐘，避免光照
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
12． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)亞硝酸鹽濃度（微摩爾/升）
13． 樣品活性計算：
 
 
五、 酶標(biāo)儀測定
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到所有孔里
3． 分別加入xx微升上述配制的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）或待測樣品（注意：細(xì)菌裂解樣品為50微克蛋白）到相應(yīng)孔里
4． 加入xx微升含有HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）和HEPENGBIO還原液（Reagent E）的HEPENGBIO反應(yīng)工作液到待測樣品孔里
5． 加入xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到標(biāo)準(zhǔn)樣品孔
6． 輕輕搖動96孔板
7． 室溫下孵育20分鐘（注意：細(xì)菌培養(yǎng)液上清樣品可以延長孵育至60分鐘）
8． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）到所有孔里
9． 輕輕搖動96孔板
10． 室溫下孵育5分鐘
11． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent G）到所有孔里
12． 輕輕搖動96孔板
13． 室溫下孵育5分鐘
14． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
15． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽濃度（微摩爾/升）
16． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)亞硝酸鹽濃度（微摩爾/升）
17． 樣品活性計算：