角鯊烯環(huán)氧化酶（squalene epoxidase；SE；EC1.14.13.132或1.14.99.7），又稱為角鯊烯單加氧酶（squalene monooxygenase）或細胞色素P450 17（cytochrome P450 17；cyp17），全稱為角鯊烯NADPH-分子氧氧化還原酶-2,3環(huán)狀氧化（squalene,NADPH:oxygen oxidoreductase ：2,3-epoxidizing），是膽固醇和植物甾醇（phytosterol）生物合成通路中關(guān)鍵性的黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucletide；FAD）依賴性的膜相關(guān)性酶，64Kd，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴（lipid droplet）中。其作用是在分子氧的存在下，催化角鯊烯（squalene）的氧化和環(huán)狀化（cyclization），立體特異性轉(zhuǎn)化為2,3-環(huán)氧化鯊烯（2,3-oxidosqualene）的反應(yīng)，即產(chǎn)生角鯊烯-羊毛甾醇轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，受到甾醇類化合物水平的調(diào)節(jié)。其功能在于新合成固醇化合物，維持膽固醇的微平衡和膜功能，影響DNA合成，與細胞生長和繁殖有關(guān)。角鯊烯環(huán)氧化酶異常，將導致動脈粥樣硬化。角鯊烯環(huán)氧化酶作為抗真菌藥物和治療高膽固醇血癥的靶標?；诘孜锝酋徬?，在分子氧的存在下，由角鯊烯環(huán)氧化酶的催化，轉(zhuǎn)化為2,3-環(huán)氧化鯊烯。其底物角鯊烯通過硫酸處理和甲醛顯色，產(chǎn)生黃色復合物，根據(jù)底物的消耗變化，即采用分光光度儀（400nm波長）的檢測，來定量分析角鯊烯環(huán)氧化酶的活性。其反應(yīng)體系如下：
 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）   毫升
HEPENGBIO溶解液（Reagent C）   毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E）   毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO底物液（Reagent G） 微升
HEPENGBIO酸性液（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO顯色液（Reagent I） 毫升
HEPENGBIO穩(wěn)定液（Reagent J） 毫升
HEPENGBIO標準液（Reagent K） 微升
產(chǎn)品說明書    1份
保存方式
 
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent A）和HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；HEPENGBIO顯色液（Reagent I）保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO酸性液（Reagent H）具有腐蝕性，注意操作安全；HEPENGBIO陰性液（Reagent E）、HEPENGBIO底物液（Reagent G）和HEPENGBIO標準液（Reagent K）具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋；有效保證3月
 
用戶自備
 
15毫升離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
細胞刮脫棒：用于細胞脫離
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
超速離心機：用于樣品操作
培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。
 
一、 樣品準備
 
1． 準備好75cm²細胞培養(yǎng)瓶或100mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁷細胞）
2． 小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11． 強力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為10000g
14． 小心移取1毫升上清液到新的預(yù)冷的超速離心管
15． 放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
16． 小心抽去上清液
17． 加入xx微升HEPENGBIO溶解液（Reagent C），混勻顆粒群
18． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
19． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準備
 
1． 準備好待測樣品（例如微粒體樣品等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）
2． 設(shè)定好分光光度儀：波長為400nm，并置零  
3． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）到2至5號管
5． 移取xx微升HEPENGBIO標準液（Reagent K）到1號管
6． 小心移取xx微升1號管的HEPENGBIO標準液（Reagent K）到2號管，混勻
7． 小心移取xx微升2號管稀釋的HEPENGBIO標準液（Reagent K）到3號管，混勻
8． 小心移取xx微升3號管稀釋的HEPENGBIO標準液（Reagent K）到4號管，混勻
9． 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表
 

管號	HEPENGBIO陰性液（Reagent E）	HEPENGBIO標準液（Reagent K）	測定體系 標準角鯊烯濃度
1	0	xx微升	1毫摩爾/升
2	xx微升	xx微升	0.5毫摩爾/升
3	xx微升	xx微升	0.25毫摩爾/升
4	xx微升	xx微升	0.125毫摩爾/升
5	xx微升	0	0

 
三、 標準曲線測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent D）到2毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent F）
3． 加入10微升上述配制的標準液
4． 在37℃溫度下孵育30分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO酸性液（Reagent H），混勻
6． 在70℃溫度下孵育5分鐘
7． 室溫下冷卻
8． 緩慢加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent I），混勻
9． 加入xx微升HEPENGBIO穩(wěn)定液（Reagent J），混勻
10． 轉(zhuǎn)移到比色皿
11． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
12． 重復實驗步驟1至11四次
13． 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準角鯊烯濃度（毫摩爾/升）
 
四、 背景測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent D）到2毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent F）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent G）
4． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）
5． 在37℃溫度下孵育30分鐘
6． 加入xx微升HEPENGBIO酸性液（Reagent H），混勻
7． 在70℃溫度下孵育5分鐘
8． 室溫下冷卻
9． 緩慢加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent I），混勻
10． 加入xx微升HEPENGBIO穩(wěn)定液（Reagent J），混勻
11． 轉(zhuǎn)移到比色皿
12． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
13． 根據(jù)標準曲線獲得背景對應(yīng)角鯊烯濃度（毫摩爾/升）
 
五、 樣品活性測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent D）到2毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent F）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent G）
4． 加入10微升待測樣品（總量100微克微粒體蛋白）
5． 在37℃溫度下孵育30分鐘
6． 加入xx微升HEPENGBIO酸性液（Reagent H），混勻
7． 在70℃溫度下孵育5分鐘
8． 室溫下冷卻
9． 緩慢加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent I），混勻
10． 加入xx微升HEPENGBIO穩(wěn)定液（Reagent J），混勻
11． 轉(zhuǎn)移到比色皿
12． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
13． 根據(jù)標準曲線獲得樣品活性對應(yīng)角鯊烯濃度（毫摩爾/升）
 
六、 計算樣品活性