角鯊烯環(huán)氧化酶（squalene epoxidase；SE；EC1.14.13.132或1.14.99.7），又稱為角鯊烯單加氧酶（squalene monooxygenase）或細(xì)胞色素P450 17（cytochrome P450 17；cyp17），全稱為角鯊烯NADPH-分子氧氧化還原酶-2,3環(huán)狀氧化（squalene,NADPH:oxygen oxidoreductase  ：2,3-epoxidizing），是膽固醇和植物甾醇

（phytosterol）生物合成通路中關(guān)鍵性的黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucletide；FAD）依賴性的膜相關(guān)性酶，64Kd，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴（lipid droplet）中。其作用是在分子氧的存在下，催化角鯊烯（squalene）的氧化和環(huán)狀化（cyclization），立體特異性轉(zhuǎn)化為2,3-環(huán)氧化鯊烯（2,3-oxidosqualene）的反應(yīng)，即產(chǎn)生角鯊烯-羊毛甾醇轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，受到甾醇類(lèi)化合物水平的調(diào)節(jié)。其功能在于新合成固醇化合物，維持膽固醇的微平衡和膜功能，影響DNA合成，與細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖有關(guān)。角鯊烯環(huán)氧化酶異常，將導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。角鯊烯環(huán)氧化酶作為抗真菌藥物和治療高膽固醇血癥的靶標(biāo)。基于底物角鯊烯，在分子氧的存在下， 由角鯊烯環(huán)氧化酶的催化，轉(zhuǎn)化為2,3-環(huán)氧化鯊烯。其底物角鯊烯通過(guò)硫酸處理和甲醛顯色，產(chǎn)生黃色復(fù)合物，根據(jù)底物的消耗變化，即采用分光光度儀（400nm波長(zhǎng)）的檢測(cè)，來(lái)定量分析角鯊烯環(huán)氧化酶的活性。其反應(yīng)體系如下：
 
H+ + NADPH + O2 + squalene → (S)-2,3-epoxysqualene + H2O + NADP+
 
 

產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO 裂解液（Reagent A）	10 毫升
HEPENGBIO 強(qiáng)化液（Reagent B）	2 毫克
HEPENGBIO 溶解液（Reagent C）	5 毫升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent D）	3 毫升
HEPENGBIO 陰性液（Reagent E）	10 毫升
HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent F）	250 微升
HEPENGBIO 底物液（Reagent G）	500 微升
HEPENGBIO 酸性液（Reagent H）	15 毫升
HEPENGBIO 顯色液（Reagent I）	10 毫升

HEPENGBIO 穩(wěn)定液（Reagent J） 10 毫升
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent K） 500 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1 份

保存方式

 
保存 HEPENGBIO 裂解液（Reagent A）和 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；HEPENGBIO 顯色液（Reagent I）保存在室溫下；其余的保存在 4℃冰箱里；HEPENGBIO 酸性液（Reagent H）具有腐蝕性，注意操作安全；HEPENGBIO 陰性液（Reagent E）、HEPENGBIO 底物液（Reagent G）和 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent K）具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋；有效保證 3 月
 

用戶自備

 
15 毫升離心管：用于樣品操作的容器
2 毫升離心管：用于樣品操作的容器
1.5 毫升離心管：用于樣品操作的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作超速離心機(jī)：用于樣品操作
培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物 比色皿：用于比色的容器 分光光度儀：用于比色分析
 

實(shí)驗(yàn)步驟

 
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、 樣品準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好 10 毫升待測(cè)的新鮮真菌/酵母細(xì)胞（OD600＝0.4 至 0.8，即 1 至 2 X 107 細(xì)胞/毫升）
2. 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管
3. 置于冰槽里 5 分鐘
4. 放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 1000g
5. 小心抽去上清液
6. 加入 250 微升 HEPENGBIO 裂解液（Reagent A），充分混勻
7. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管
8. 加入 100 微克 HEPENGBIO 強(qiáng)化液（Reagent B）
9. 強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒
10. 置于冰槽里 1 分鐘
11. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 9 至 10 五次
12. 加入 250 微升 HEPENGBIO 裂解液（Reagent A），充分混勻
13. 放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 15 分鐘，速度為 10000g
14. 小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的超速離心管
15. 放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)離心 60 分鐘，速度為 100000g
16. 小心抽去上清液
17. 加入 200 微升 HEPENGBIO 溶解液（Reagent C），混勻顆粒群

18. 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
HEPENGBIO30030.1）
19. 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、測(cè)定準(zhǔn)備
 
1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如微粒體樣品等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）
2. 設(shè)定好分光光度儀：波長(zhǎng)為 400nm，并置零
3. 準(zhǔn)備好 5 個(gè) 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號(hào)管
4. 分別加入 50 微升 HEPENGBIO 陰性液（Reagent E）到 2 至 5 號(hào)管
5. 移取 100 微升 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent K）到 1 號(hào)管
6. 小心移取 50 微升 1 號(hào)管的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent K）到 2 號(hào)管，混勻
7. 小心移取 50 微升 2 號(hào)管稀釋的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent K）到 3 號(hào)管，混勻
8. 小心移取 50 微升 3 號(hào)管稀釋的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent K）到 4 號(hào)管，混勻
9. 將 1 至 5 號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表
 

管號(hào)	HEPENGBIO 陰性液（Reagent E）	HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent K）	測(cè)定體系 標(biāo)準(zhǔn)角鯊烯濃度
1	0	100 微升	1 毫摩爾/升
2	50 微升	50 微升	0.5 毫摩爾/升
3	50 微升	50 微升	0.25 毫摩爾/升
4	50 微升	50 微升	0.125 毫摩爾/升
5	50 微升	0	0

 
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
 
 
1. 移取 80 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent D）到 2 毫升離心管
2. 加入 10 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent F）
3. 加入 10 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
4. 在 37℃溫度下孵育 30 分鐘
5. 加入 400 微升 HEPENGBIO 酸性液（Reagent H），混勻
6. 在 70℃溫度下孵育 5 分鐘
7. 室溫下冷卻
8. 緩慢加入 250 微升 HEPENGBIO 顯色液（Reagent I），混勻
9. 加入 250 微升 HEPENGBIO 穩(wěn)定液（Reagent J），混勻
10. 轉(zhuǎn)移到比色皿
11. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
12. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 1 至 11 四次
13. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)角鯊烯濃度（毫摩爾/升）四、 背景測(cè)定
1. 移取 70 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent D）到 2 毫升離心管
2. 加入 10 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent F）
3. 加入 10 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent G）

4. 加入 10 微升 HEPENGBIO 陰性液（Reagent E）
5. 在 37℃溫度下孵育 30 分鐘
6. 加入 400 微升 HEPENGBIO 酸性液（Reagent H），混勻
7. 在 70℃溫度下孵育 5 分鐘
8. 室溫下冷卻
9. 緩慢加入 250 微升 HEPENGBIO 顯色液（Reagent I），混勻 10．加入 250 微升 HEPENGBIO 穩(wěn)定液（Reagent J），混勻 11．轉(zhuǎn)移到比色皿
12. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
13. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得背景對(duì)應(yīng)角鯊烯濃度（毫摩爾/升） 五、 樣品活性測(cè)定
1. 移取 70 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent D）到 2 毫升離心管
2. 加入 10 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent F）
3. 加入 10 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent G）
4. 加入 10 微升待測(cè)樣品（總量 100 微克微粒體蛋白）
5. 在 37℃溫度下孵育 30 分鐘
6. 加入 400 微升 HEPENGBIO 酸性液（Reagent H），混勻
7. 在 70℃溫度下孵育 5 分鐘
8. 室溫下冷卻
9. 緩慢加入 250 微升 HEPENGBIO 顯色液（Reagent I），混勻 10．加入 250 微升 HEPENGBIO 穩(wěn)定液（Reagent J），混勻 11．轉(zhuǎn)移到比色皿
12. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
13. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)角鯊烯濃度（毫摩爾/升） 六、 計(jì)算樣品活性
{[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得背景對(duì)應(yīng)角鯊烯濃度（毫摩爾/升）—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)角鯊烯濃度（毫摩爾/ 升）]X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)}÷[ 0.01（樣品容量；毫升） X 30（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝微摩爾角鯊烯/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾角鯊烯/毫克/分鐘