超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基

（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡，甚而導(dǎo)致諸如冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統(tǒng)內(nèi)，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素
（bilirubin）等，產(chǎn)生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達(dá)到消除或降低ROS的損害。通過穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical；DPPH），受到抗氧化劑的去自由基作用，呈現(xiàn)深紫色轉(zhuǎn)化為黃色的變化，衡量體系中抗氧化劑捕獲自由基、消耗抗氧化劑的能力，在分光光度儀（515nm波長）的幫助下，觀察其峰值下降的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。
 

產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO 清理液（Reagent A）	500 毫升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）	20 毫升
HEPENGBIO 染色液 A（Reagent C1）	1 瓶
HEPENGBIO 染色液 B（Reagent C2）	10 毫升
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）	200 微升
產(chǎn)品說明書	1 份
保存方式

 
保存 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，有效保證 6 月

用戶自備

 
50 毫升燒杯：用于樣品操作的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5 毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制的容器
4℃臺式離心機(jī)：用于樣品操作
200 微升 1 厘米光徑比色皿或 96 孔板：用于比色的容器分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、 樣品準(zhǔn)備

 
 
1、固態(tài)食品處理
1. 秤取 1 克固態(tài)食品或粉末到 50 毫升燒杯，杯口封口膜密封
2. 加入 8 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
3. 攪拌 30 分鐘，充分混勻
4. 繼續(xù)加入 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）到終容量為 10 毫升
5. 過濾紙過濾，去除不溶性固體顆粒
6. 封口膜封口備用
 

2、液態(tài)食品處理

1. 移取 5 毫升待測液態(tài)食品到 15 毫升錐形離心管
2. 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1500g
3. 移取上清液到新的 15 毫升錐形離心管
4. （選擇步驟）可以加入適量的 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
5. （選擇步驟）過濾紙過濾（如果離心處理，樣品仍然不清澈）
6. 置于冰槽里備用或放進(jìn)-20 冰箱里保存二、標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好 5 個(gè) 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號管
2. 分別加入 50 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）到 2 至 5 號管
3. 移取 100 微升 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 1 號管，混勻
4. 小心移取 50 微升 1 號管的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 2 號管，混勻
5. 小心移取 50 微升 2 號管稀釋的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 3 號管，混勻
6. 小心移取 50 微升 3 號管稀釋的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 4 號管，混勻
7. 將 1 至 5 號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
 

管號	HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）	HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）	測定體系 標(biāo)準(zhǔn) Trolox 濃度
1	0	100 微升	80 微摩爾/升
2	50 微升	50 微升	40 微摩爾/升
3	50 微升	50 微升	20 微摩爾/升

4	50 微升	50 微升	10 微摩爾/升
5	50 微升	0	0

 

三、 樣品測讀

 
 
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取 5 毫升 HEPENGBIO 染色液 B（Reagent C2） 到 1 瓶 HEPENGBIO 染色液 A（Reagent C1）里，混勻，置于暗室里，標(biāo)記為 HEPENGBIO 染色工作液， 避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
 
1. 準(zhǔn)備 1 個(gè) 96 孔板，做好標(biāo)記：空白對照孔、標(biāo)準(zhǔn)樣品孔、待測樣品孔
2. 分別移取 205 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）到 96 孔板里的每個(gè)孔里
3. 分別加入 25 微升 HEPENGBIO 染色工作液
4. 加入 20 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent B）到空白對照孔
5. 加入 20 微升上述配制的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里
6. 加入 20 微升樣品（100 微克食品總量）到待測樣品孔里
7. 輕輕搖動 96 孔板，使其混勻
8. 室溫下孵育 15 分鐘
9. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里測讀：515nm 波長
10. 分析結(jié)果：
1） 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為吸光單位（OD₅₁₅nm）；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)Trolox 濃度（微摩爾/升）
2） 空白對照孔為最大吸光單位（OD₅₁₅nm）讀數(shù)
3） 標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和待測樣品孔為實(shí)際吸光單位（OD₅₁₅nm）讀數(shù)
4） 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng) Trolox 濃度（微摩爾/升）
5） 計(jì)算樣品實(shí)際總抗氧化能力
 
【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)Trolox 濃度（微摩爾/升）X 0.25（體系容量；毫升） X 樣品稀釋倍數(shù)】÷0.02
（樣品容量；毫升）＝（微摩爾/升 TROLOX 等值）
 
6） 根據(jù)下列公式計(jì)算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實(shí)際抑制百分率）
 
【（空白對照孔吸光單位讀數(shù)－實(shí)際吸光單位讀數(shù)）÷空白對照孔吸光單位讀數(shù)】X 100％
 
7） IC50：50％抑制率所需的樣品單位：TROLOX 等值或樣品重量（毫克/毫升）或樣品容量（微升）
 
X（所需樣品單位）＝（已知樣品單位÷實(shí)際抑制百分率）X 50％