腺苷三磷酸酶，又稱為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。ATP酶的去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進出細胞。根據(jù)ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能，分為五類不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型，又稱為E1E2 型，存在于細菌和真核細胞膜和細胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運輸各種化學(xué)分子，包括Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細菌型等，其中胃氫/鉀ATP酶，一種與胃酸分泌相關(guān)的質(zhì)子泵，屬于這一類型。V型，又稱為V1V0型，主要存在于真核細胞的液泡（vacuole）中。A型，又稱為A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，為細胞表面的酶。V型，又稱為V1V0型，也稱為氫V型ATP酶，主要存在于所有真核細胞的囊泡（vacuole或vesicle）中。F型ATP酶（F type ATPase），又稱為ATP合成酶（ATP synthase）、F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase）和線粒體呼吸鏈復(fù)合物V（complex V），主要在線粒體、葉綠體或細菌細胞膜上，進行氧化磷酸化或光合作用。其中葉綠體ATP合酶（chloroplast ATP synthase），又稱為CF1F0ATP酶。F型ATP酶主要有兩個結(jié)構(gòu)域：F0為質(zhì)子通道，由15亞體蛋白構(gòu)成，包括I1II1III12IV1等；和F1催化活性結(jié)構(gòu)域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構(gòu)成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。CF型ATP酶的主要功能在于通過跨膜質(zhì)子梯度，形成光合成電子傳導(dǎo)（photosynthetic electron transport），產(chǎn)生細胞所需的能量ATP?；贏TP，在寡霉素參與下，受到F型ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析CF型ATP酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）      毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）      毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E）   毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO專性液（Reagent G）   微升
產(chǎn)品說明書    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D），避免光照，有效保證6月
 
用戶自備
 
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細胞
尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)：用于去除植物裂解殘渣
小型漏斗：用于過濾的裝置
微型臺式離心機：用于樣品制備
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿：用于光譜分析的容器
分光光度儀：用于光譜分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。
 
一、 樣品準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物葉片組織，并秤重以確定200毫克組織重量 
2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 用刀片切碎組織（注意：建議去除葉莖）
5． 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
9． 置于冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下） 
10． （選擇步驟）準(zhǔn)備1個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
11． （選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過濾（注意：可以使用4層紗布替代）
12． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為200g
13． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物） 
14． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
15． 小心抽去上清液，保留綠色沉淀顆粒，避免光照——
16． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻沉淀顆粒群
17． （選擇步驟）進行葉綠素定量測定（建議使用HEPENGBIO植物葉綠體總蛋白定量檢測試劑盒－HEPENGBIO16009）
18． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里保存
 
二、測定準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好上述待測樣品，放進60℃恒溫水槽孵育4分鐘，然后放進冰槽里備用 
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔2分鐘，讀數(shù)6次（共10分鐘），并置零
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 背景對照測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘
 
四、 樣品總活性測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5． 加入100微升待測樣品（注意：100微克葉綠體蛋白；樣品須溶解）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘
 
五、 樣品非特異活性測定
 
實驗開始前，移取100微升待測樣品（注意：100微克葉綠體蛋白；樣品須溶解）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent G），混勻后，放進37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
5． 加入120微升上述預(yù)處理的待測樣品
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘
 
六、 計算樣品活性
 
1）樣品活性（總活性和非特異活性）
 
 
2）樣品特異活性
 
 
七、 酶標(biāo)板測定
 
1） 樣品總活性測定
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品總活性
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板中
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
6． 在37℃溫度下孵育3分鐘
7． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）或待測樣品（注意：50微克葉綠體蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
8． 輕輕搖動酶標(biāo)板
9． 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和10分鐘讀數(shù)
10． 背景對照和樣品總活性實際讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘
11． 活性計算
 
 
 
 
2） 樣品非特異活性測定
 
實驗開始前，移取25微升待測樣品（注意：50微克葉綠體蛋白；樣品須溶解）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent G），混勻后，放進37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用
 
1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品
2． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板中
3． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
6． 在37℃溫度下孵育3分鐘
7． 加入30微升上述預(yù)處理的待測樣品
8． 輕輕搖動酶標(biāo)板
9． 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和10分鐘讀數(shù)
10． 樣品非特異活性實際讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘
11． 活性計算
 
 
 
3） 樣品特異活性計算