腺苷三磷酸酶，又稱(chēng)為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無(wú)機(jī)磷。ATP酶的去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進(jìn)出細(xì)胞。根據(jù)ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能，分為五類(lèi)不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型，又稱(chēng)為E1E2 型，存在于細(xì)菌和真核細(xì)胞膜和細(xì)胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運(yùn)輸各種化學(xué)分子，包括Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細(xì)菌型等，其中胃氫/鉀ATP酶，一種與胃酸分泌相關(guān)的質(zhì)子泵，屬于這一類(lèi)型。V型，又稱(chēng)為V1V0型，主要存在于真核細(xì)胞的液泡（vacuole）中。A型，又稱(chēng)為A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，為細(xì)胞表面的酶。V型，又稱(chēng)為V1V0型，也稱(chēng)為氫V型ATP酶，主要存在于所有真核細(xì)胞的囊泡（vacuole或vesicle）中。F型ATP酶（F type ATPase），又稱(chēng)為ATP合成酶（ATP synthase）、F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase）和線粒體呼吸鏈復(fù)合物V（complex V），主要在線粒體、葉綠體或細(xì)菌細(xì)胞膜上，進(jìn)行氧化磷酸化或光合作用。細(xì)菌質(zhì)膜型F型ATP酶主要有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：F0為質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，由3個(gè)膜蛋白構(gòu)成，包括a、b、c等；和F1催化活性結(jié)構(gòu)域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構(gòu)成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。細(xì)菌F型ATP酶的主要功能通過(guò)ATP合成的逆向反應(yīng)，水解ATP，產(chǎn)生膜內(nèi)外質(zhì)子梯度變化，幫助細(xì)菌離子轉(zhuǎn)運(yùn)和鞭毛運(yùn)動(dòng)（flagella motility）?；贏TP，在寡霉素參與下，受到F型ATP酶的水解，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析F型 ATP酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO裂解液（Reagent A）    毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent B）  毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）  毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）       毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E）    毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）  微升
HEPENGBIO專(zhuān)性液（Reagent G）    微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D），避免光照，有效保證6月
 
用戶(hù)自備
 
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
恒溫?fù)u床：用于細(xì)菌培養(yǎng)
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度儀：用于光度分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。
 
一、 樣品準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好10毫升待測(cè)的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí)，速度為220RPM
2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升
3． 置于冰槽里5分鐘
4． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
5． 小心抽去上清液
6． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混勻
7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
8． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
9． 置于冰槽里30分鐘，期間強(qiáng)力渦旋震蕩15秒三次
10． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）
11． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
12． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心去掉上清液 
14． 加入xx微升HEPENGBIO保存液（Reagent B），混勻
15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－ ）
16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、測(cè)定準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好上述待測(cè)樣品，置于冰槽里 
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 背景對(duì)照測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘
 
四、 樣品總活性測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5． 加入100微升待測(cè)樣品（注意：20微克膜蛋白或50微克細(xì)菌總蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng)10）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘
 
五、 樣品非特異活性測(cè)定
 
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，移取100微升待測(cè)樣品（注意：20微克膜蛋白或50微克細(xì)菌總蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng)10）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO專(zhuān)性液（Reagent G），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
5． 加入120微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘
 
六、 計(jì)算樣品活性
 
1）樣品活性（總活性和非特異活性）
 
 
 
2）樣品特異活性
 
七、 酶標(biāo)儀測(cè)定
 
1） 樣品總活性測(cè)定
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品總活性
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 輕輕搖動(dòng)96孔板
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（注意：20微克膜蛋白或50微克細(xì)菌總蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
8． 輕輕搖動(dòng)96孔板
9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
10． 背景對(duì)照和樣品總活性實(shí)際讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘
11． 活性計(jì)算
 
 
2） 樣品非特異活性測(cè)定
 
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，移取25微升待測(cè)樣品（注意：20微克膜蛋白或50微克細(xì)菌總蛋白；樣品須溶解）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO專(zhuān)性液（Reagent G），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品
2． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 輕輕搖動(dòng)96孔板
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 加入30微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
8． 輕輕搖動(dòng)96孔板
9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
10． 樣品非特異活性實(shí)際讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘
11． 活性計(jì)算
3） 樣品特異活性計(jì)算