蛋白激酶A（protein kinase A；PKA），又稱(chēng)cAMP依賴(lài)性蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase），是第二信使依賴(lài)性酶。通過(guò)影響腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase；AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase）的活性，而決定cAMP水平，達(dá)到調(diào)節(jié)PKA活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)于各種外部刺激的反應(yīng)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排等。該全酶（holoenzyme）具有兩個(gè)催化亞體和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞體構(gòu)成的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。cAMP結(jié)合調(diào)節(jié)亞體，而釋放出活化的催化亞體，產(chǎn)生目標(biāo)蛋白上絲/蘇氨酸
（serine/threonine）的磷酸化，諸如CREB、Histone H1、CREM、NF-κB和核受體等，而調(diào)控一系列細(xì)胞活動(dòng)。其磷酸化目標(biāo)序列為Arg-Arg-X-Ser/Thr或Lys-Arg-X-X- Ser/Thr。蛋白激酶A 至少有兩個(gè)亞酶：I型亞酶存在于胞漿內(nèi)，而二型亞酶與細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞骨架相關(guān)。基于底物XXXXXX，在ATP的存在下， 受到PKA激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶
（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析蛋白激酶A的活性。其反應(yīng)方式為：
 

產(chǎn)品內(nèi)容

 
HEPENGBIO 清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO 酶促液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO 底物液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO 陰性液（Reagent G） 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1 份
 

保存方式

 
保存 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證 6 個(gè)月。

用戶自備

 
PKA 激酶：用于抑制劑篩選
1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析操作的容器分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品比色分析
 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

 
 
1. 準(zhǔn)備好 25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至 5 X 10⁶細(xì)胞）
2. 小心加入 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
5. 加入 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6. 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
7. 放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入 微升 HEPENGBIO 裂解液（Reagent B），充分混勻 10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管
11. 強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒
12. 置于冰槽里孵育 30 分鐘
13. 放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）
14. 小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管
15. 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 HEPENGBIO Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
HEPENGBIO30030.1）
16. 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、 測(cè)定準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里
2. 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長(zhǎng)為 340nm，間隔 5 分鐘，讀數(shù) 7 次（共 30 分鐘），并置零三、 背景對(duì)照測(cè)定
1. 移取 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
3. 加入 微升 HEPENGBIO 陰性液（Reagent G）
4. 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘
5. （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零

6. （選擇步驟）取出比色皿
7. 加入 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent E）
8. 加入 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
9. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在                  3                                   秒之內(nèi)） 10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 30 分鐘
 

四、 樣品測(cè)定

 
 
1. 移取 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
3. 加入 5 微升待測(cè)樣品（注意：50 微克組織蛋白；樣品須溶解）
4. 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘
5. （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零
6. （選擇步驟）取出比色皿
7. 加入 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent E）
8. 加入 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
9. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在                 3                                 秒之內(nèi)） 10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 30 分鐘
 

五、 計(jì)算樣品活性六、酶標(biāo)板測(cè)定

1. 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2. 分別移取 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中
3. 分別加入 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
4. 分別加入 微升 HEPENGBIO 陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50 微克組織蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
5. 輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板
6. 在 30℃溫度下孵育 2 分鐘
7. 分別加入 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent E）
8. 分別加入 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
9. 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
10. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0 分鐘讀數(shù)和 30 分鐘讀數(shù)
11. 活性計(jì)算： 七、抑制劑篩選
1. 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、零抑制、完全抑制和待測(cè)抑制劑樣品
2. 按下表加入試劑

內(nèi)容物	樣本背景	零抑制對(duì)照 （0％抑制）	完全抑制對(duì)照 （100％抑制）	待測(cè)抑制活性
HEPENGBIO 緩沖液 （Reagent C）	微升	微升	微升	微升