細(xì)胞色素P450亞酶1A2，簡(jiǎn)稱為CYP1A2，是肝細(xì)胞微粒體復(fù)合功能氧化酶系統(tǒng)的成員之一，也是芳香族碳?xì)浠衔锛恿u基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）的成員之一。在人體肝臟里占P450酶系15％。與CYP1A1高度同源，特別是在外顯子2、4、5和6。CYP1A2由多個(gè)多態(tài)性變體，最常見的是：1A和1F，與咖啡因代謝和遲發(fā)性皮膚卟啉癥（porphyria cutanea tarda）相關(guān)。CYP1A2的作用在于體內(nèi)外源化合物

（xenobiotics），包括藥物、致癌劑、化學(xué)污染物的氧化代謝，即單加氧化作用（monooxygenation）和羥化
作用（hydroxylation）,以及脂類合成包括膽固醇和類固醇。芳香族碳?xì)浠衔镎T導(dǎo)CYP1A2的表達(dá)。甲氧基異酚噁唑脫甲基酶（7-methoxyresorufin-O-demethylase；MROD）的活性是細(xì)胞色素P450亞酶1A2的診斷標(biāo)記，其基于MROD選擇性催化細(xì)胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚噁唑（7-methoxyresorufin）在甲氧基異酚噁唑脫甲基酶的催化下，轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮（resorufin）后熒光峰值的變化（激發(fā)波長(zhǎng)530nm， 散發(fā)波長(zhǎng)590nm），來定量測(cè)定細(xì)胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚噁唑脫甲基酶反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
 
 

產(chǎn)品內(nèi)容

 
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 底物液（Reagent C） 微升
HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D） 微升
產(chǎn)品說明書 1 份
 

保存方式

 
保存在－20℃冰箱里，HEPENGBIO 底物液（Reagent C）和 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）避免光照， 有效保證 6 月
 

用戶自備

 
1.5 毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作的容器恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)
比色皿或黑色 96 孔板：用于反應(yīng)和熒光分析的容器熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析
 

實(shí)驗(yàn)步驟

 
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、 測(cè)定準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
2. 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為 37℃）：激發(fā)波長(zhǎng) 530nm，散發(fā)波長(zhǎng) 590nm，并置零
3. 準(zhǔn)備好 5 個(gè) 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號(hào)管
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到 1 號(hào)管
5. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到 2 至 5 號(hào)管
6. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 1 號(hào)管，混勻
7. 小心移取 xx 微升 1 號(hào)管稀釋的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 2 號(hào)管，混勻
8. 小心移取 xx 微升 2 號(hào)管稀釋的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 3 號(hào)管，混勻
9. 小心移取 xx 微升 3 號(hào)管稀釋的 HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 4 號(hào)管，混勻
10. 將 1 至 5 號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
 

管號(hào)	HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）	HEPENGBIO 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）	標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度
1	xx 微升	xx 微升	xx 納摩爾/升
2	xx 微升	xx 微升 1 號(hào)管	xx 納摩爾/升
3	xx 微升	xx 微升 2 號(hào)管	xx 納摩爾/升
4	xx 微升	xx 微升 3 號(hào)管	xx 納摩爾/升
5	xx 微升	0	0

 

二、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

 
 
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent B）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
4. 加入 100 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
5. 上下傾倒數(shù)次，混勻
6. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘
7. 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)獲得相對(duì)熒光單位
8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 1 至 7 四次
9. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）

三、 樣品測(cè)定

 
 
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent B）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
4. 加入 100 微升待測(cè)樣品（20 微克微粒體蛋白或 100 微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
5. 上下傾倒數(shù)次，混勻
6. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘
7. 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光單位
8. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升） 四、 計(jì)算樣品活性
 

五、 熒光酶標(biāo)儀測(cè)定

 
 
1. 在黑色 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品
2. 分別移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔里
3. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent B）
4. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
5. 分別加入 25 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（20 微克微粒體蛋白或 100 微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）
（注意：樣品須清澈）
6. 輕輕搖動(dòng)黑色 96 孔板
7. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘
8. 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光單位
9. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）
10. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）
11. 活性計(jì)算：
 
 

注意事項(xiàng)

 
1. 本產(chǎn)品為 25 次（比色皿）或 85 次（黑色 96 孔板）操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
2. 操作時(shí)，須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需 1 次
4. 樣 品 須 澄 清 ， 至 關(guān) 重 要 （ 本 公 司 提 供 HEPENGBIO 細(xì) 胞 可 溶 性 總 蛋 白 質(zhì) 制 備 試 劑 盒
HEPENGBIO30002.1）
5. 熒光檢測(cè)易受到蛋白的干擾，例如牛血清白蛋白（bovine serum albumin；BSA）會(huì)與羥基異吩噁唑酮
（resorufin）結(jié)合，導(dǎo)致熒光讀數(shù)的降低
6. 如果樣品讀數(shù)低于背景讀數(shù)明顯，建議使用失活的樣品作為樣品背景對(duì)照，以及標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定
7. 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
8. 如果酶活性過低，可以增加反應(yīng)時(shí)間至 30 分鐘
9. 熒光測(cè)定后，比色皿須清洗徹底