超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基
（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等 細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡，甚而導(dǎo)致植物氣孔關(guān)閉（stomatal closure）和根毛發(fā)育（root hair）異常等病理狀況。魯米諾（luminol），又稱氨基鄰苯二甲酰肼（luminol；3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一種脂溶性的發(fā)光劑，氧化后生成魯米諾自由基而化學(xué)發(fā)光，具有460nm左右峰值的帶狀光譜，肉眼可觀察到鮮明的紫藍(lán)色。魯米諾以單價氧化形式與超氧自由基陰離子反應(yīng)，產(chǎn)生不穩(wěn)定性內(nèi)過氧化物或二氧環(huán)丁烷（Dioxetane），由此分解成電激發(fā)狀態(tài)，通過釋放光子，回復(fù)到基態(tài)。魯米諾作為探針，可以檢測植物中過氧化氫、超氧自由基陰離子和羥自由基，其中過氧化氫最強(qiáng)，其發(fā)光強(qiáng)度與過氧化氫水平成正相關(guān)。
 

產(chǎn)品內(nèi)容

 
HEPENGBIO 清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 強(qiáng)化液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 發(fā)光液（Reagent C） 毫升
產(chǎn)品說明書 1 份
 

保存方式

 
保存 HEPENGBIO 強(qiáng)化液（Reagent B）和HEPENGBIO 發(fā)光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在 4℃冰箱里；有效保證 6 月
 

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5 毫升離心管：用于樣品操作的容器微型臺式離心機(jī)：用于去除樣品雜質(zhì)
DOUNCE 勻漿器：用于裂解植物組織樣品超聲儀：用于裂解植物組織樣品
測試管或黑色 96 孔板：用于發(fā)光檢測用的容器化學(xué)發(fā)光儀：用于檢測化學(xué)發(fā)光
 

實驗步驟

 
一、 樣品預(yù)處理
 
 
1. 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定 500 毫克組織重量
2. （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管
3. （選擇步驟）加入 xx 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）清洗 1 次
4. 即刻用刀片切碎組織
5. 放進(jìn)一個預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管
6. 加入預(yù)冷的 xx 毫升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
7. 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻
8. 即刻放進(jìn)預(yù)冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約 80 下）
9. 將所有組織勻漿物移入 1.5 毫升離心管
10. 強(qiáng)力渦旋震蕩 5 秒，充分混勻
11．（選擇步驟）在冰槽里，置于 200 瓦超聲儀下，功率 50％，猝擊 5 秒
12. 放進(jìn) 4℃微型臺式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 5000g（或 7500RPM，例如 eppendorf 5415）
13. 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管
14．（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心 5 分鐘一次，速度為 5000g（或 7500RPM， 例如 eppendorf 5415）
15．（選擇步驟）移取 5 微升進(jìn)行蛋白定量測定，并調(diào)整蛋白濃度為 20 毫克/毫升（注意：建議使用
HEPENGBIO Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
16．置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作（1 小時內(nèi)） 二、 測讀
測讀開始前，打開化學(xué)發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為 37℃預(yù)熱和整合測讀 10 秒或 15 分鐘；然后關(guān)掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴(yán)格置于暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
 
1. 準(zhǔn)備好測試管，做好標(biāo)記：陰性對照、樣品本底和樣品活性
2. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）到陰性對照測試管
3. 移取 400 微升上述預(yù)處理的待測樣品到樣品本底測試管
4. 移取 400 微升上述預(yù)處理的待測樣品到樣品活性測試管
5. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO 強(qiáng)化液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管外
6. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO 發(fā)光液（Reagent C）到上述測試管，除樣品本底測試管外
7. 輕輕渦旋混勻
8. 即刻放進(jìn) 37℃化學(xué)發(fā)光儀里測讀